ченые МГУ имени М.В.Ломоносова совместно с коллегами создали надежный и приемлемый по затратам высокопроизводительный метод, позволяющий ускорять и улучшать поиск новых антимикробных препаратов. Ими создана система, не только измеряющая антимикробную активность, но и одновременно определяющая механизм действия нового вещества. Результаты опубликованы в высокорейтинговом журнале Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
Дилемма антибиотика
Бактерии постоянно вырабатывают резистентность к антибиотикам, поэтому человечество вынуждено проводить последние десятилетия в поисках все новых и новых веществ, позволяющих решить эту проблему. Главным методом поиска является высокопроизводительный скрининг — испытание огромного количества веществ, как из химических библиотек, так и новых природных соединений. Однако никаких данных о механизме действия такие эксперименты не дают. Для увеличения эффективности методики необходимо искать пути снижения стоимости реагентов, автоматизации процесса и уменьшения количества стадий этой работы.
Уже сейчас существуют штаммы широкого спектра, которые помогают определять активность разных видов антибиотиков. Комбинация этих штаммов могла бы дать большую выгоду, ускорив процесс поиска нужных соединений и понимания механизмов их работы, но это требует множества проверок каждого вещества. Ученые сталкиваются с дилеммой: проверять одновременно много веществ по одному признаку, или же много признаков одного вещества, чтобы понять, на что же именно оно воздействует. Оба пути несовершенны, но российские ученые попытались найти компромисс, использовав плюсы обоих подходов.
«Нами был разработан подход, позволяющий in vivo определять механизм действия новых потенциальных антибактериальных препаратов, одновременно с определением эффективности, — сообщает автор исследования Илья Остерман, кандидат химических наук, научный сотрудник кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, лауреат премии Правительства РФ в области науки и техники для молодых ученых за 2016 год. — Благодаря автоматизации метода было возможно анализировать тысячи соединений в день».
Выходила на берег Katushka — прекращал свой синтез триптофан
Созданная репортерная система (в молекулярной биологии так называют вставленные в организм гены-репортеры или маркеры, которые помогают измерять, насколько активно работают другие гены) основана на генах, кодирующих два флуоресцентных белка. Один из них — дальне-красный белок Katushka2S, который являлся маркером для остановки трансляции — синтеза белков, и свет его можно было увидеть, если производство белка застопорилось из-за остановки следования рибосом по цепи РНК.
Перед геном белка Katushka2S был вставлен регуляторный элемент триптофанового оперона, который в геноме содержит инструкции по биосинтезу аминокислоты триптофана. Опероном называют функциональную группу генов, часть из которых кодирует белки, вместе выполняющие какую-либо работу, а другая часть регулирует количество этих белков, усиливая или подавляя их синтез при необходимости. В триптофановом опероне находится аттенюатор — участок генома, на котором в условиях избытка триптофана останавливается транскрипция.
Гены биосинтеза триптофана были заменены на ген белка Katushka2S. Сам аттенюатор также был изменен: вместо трехбуквенного кодона аминокислоты триптофана в составе закодированных ферментов был вставлен кодон аланина.Такой модифицированный аттенюатор перестал реагировать на концентрацию триптофана, однако, стал зависеть от антибиотиков нарушающих синтез белка — в их присутствии белка Katushka2S становится много.
«На первом этапе была создана генно-инженерная конструкция с использование двух флуоресцентных белков, экспрессия первого зависела от присутствия ингибиторов синтеза белка, а второго – от присутствия ингибиторов синтеза ДНК. Затем при помощи гиперчувствительного штамма кишечной палочки был создан репортер для детекции соответствующих типов антибиотиков», — рассказывает Илья Остерман о своей работе.
Дать красный свет синтезу ДНК
Каким же был второй флуоресцентный белок? Им стал RFP (red fluorescent protein — красный флуоресцентный белок). Интересно, что цвет также имеет значение: оба белка светят в том диапазоне (красного и дальне-красного цвета), который довольно хорошо пропускают ткани человека.
Ген RFP были вставлен таким образом, чтобы начинать работать во время SOS-ответа — реакции клетки на стрессовые, неблагоприятные условия, требующие повышенной внимательности со стороны систем ремонта повреждений ДНК. По замыслу ученых, этот процесс должен был запускать синтез красного флуоресцентного белка, который, как предупреждающая красная лампочка, может оповещать о том, что в бактериальной клетке что-то пошло не так. Чем больше будет красного света, тем сильнее действует антибиотик.
Как собрать такую репортерную систему? Для этого ученые поместили ген RFP сразу же после промотора (области, с которой рибосома, главный органоид белкового синтеза, идя по цепи, узнает старт последовательности, где записан белок) гена sulA, запускающегося на поздних стадиях SOS-ответа и подавляющего клеточное деление. Таким образом, как только ген sulA начинает работать, с ним в связке тут же начинает синтезироваться и красный флуоресцентный белок. Похожим образом работал и белок Katushka2S в триптофановом опероне, только оповещал он красным светом другой длины волны об остановке синтеза белка, а не ДНК.
Эта система двух репортеров уже была протестирована на выяснении активности нового антибиотика амикоумацина, для которого ранее не была известна мишень, которую он поражает, а также ряда других антибиотиков.
«Уже сейчас при помощи данного подхода нами проанализировано более пятидесяти тысяч соединений, обнаружены новые ингибиторы синтеза белка и синтеза ДНК, которые в дальнейшем могут стать основой для новых антимикробных лекарств. Процесс скрининга также будет продолжаться», — заключил ведущий автор исследования.
Исследование выполнено совместно с сотрудниками МФТИ и Сколковского института науки и технологий, а также Института по изысканию новых антибиотиков им. Гаузе.