Учёные МГУ совместно с коллегами провели анализ защитного кожного секрета травяной лягушки Rana temporaria из популяции, обитающей в Центральной Словении, и сравнили результаты тестов с таковыми для московских земноводных. Оказалось, что состав секрета животных разных регионов различается, а значит, по нему можно определить их родину. Кроме того, авторы усовершенствовали безопасный для лягушек способ, помогающий получить больше слизи, а также разработали эффективные методики работы с ней. Они лягут в основу исследований биологических активностей кожного секрета — его противомикробные и регенеративные свойства помогут разработать новые лекарства. Результаты исследования, поддержанного грантом Президентской программы Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале Analytical and Bioanalytical Chemistry.
Травяные ранидные лягушки — один из самых распространенных родов лягушек в Европе. Слизь с поверхности кожи — их единственная защита от всех опасностей. Поэтому в процессе эволюции у каждой популяции сложился уникальный состав кожного секрета в зависимости от возможных угроз, существующих в конкретной среде обитания. В одних группах активные пептиды слизи вызывают рвотный рефлекс у рыб, заставляя их выплюнуть жертву. Слизь травяных лягушек из других местностей вызывает такую боль у хищных птиц, что те не могут закрыть клюв и проглотить добычу. Пептиды других популяций отвечают за защиту от грибков, вирусов и вредных бактерий и способны ускорять регенерацию мягких тканей. Поэтому для ученых важно изучить состав и структуру каждого пептида и понять, как именно он действует.
Для определения структуры активных веществ авторы использовали метод масс-спектрометрического анализа с предварительным хроматографическим разделением компонентов смеси: ионизируя молекулы вещества, они фиксировали отношение их массы к заряду, и с учетом атомных масс элементов устанавливали состав молекул и их активных фрагментов. Сравнивая пептиды словенской и московской популяции травяных лягушек, ученым удалось не только сделать прогноз о функциях найденных пептидов, но и найти новый способ различать виды и популяции лягушек.
«Часто бывает сложно определить, к какому виду относятся особи, ведь они очень похожи между собой. Даже у опытных биологов с этим возникают проблемы. Однако теперь, когда известно, что у каждого вида лягушек есть свой собственный набор пептидов, определить принадлежность особи будет легко. Более того, теперь существует возможность узнать и то, к какой именно популяции она относится — ранее не было ни одного способа, позволяющего это сделать. Так что мы можем говорить о настоящем открытии», — поделился профессор кафедры органической химии химического факультета МГУ Альберт Лебедев.
Основная цель исследователей — найти такой способ изучения структуры пептидов, при котором не нужно будет проводить дополнительные химические реакции, предваряющие масс-спектрометрический анализ и приводящие к потерям целевых компонентов или загрязнению образца побочными продуктами. Есть проблемы и с количеством образцов, поскольку сбор кожного секрета лягушек — также трудоемкий процесс. Обычного количества кожного секрета, выделяемого одной особью, недостаточно.
Авторы статьи использовали безвредный для лягушек метод мягкого электростимулирования, разработанный в Австралии в конце прошлого века. Ученые водили вдоль спин амфибий электродами, после чего слизь начинала выделяться более эффективно. Такая процедура проводится раз в пару недель, чтобы подопытные смогли восстановить «баланс» секрета.
Наконец, основная сложность состоит в том, что активные пептиды, выделяемые организмом лягушки, выполняют свою функцию в считанные секунды. Уже через минуту в только что взятом образце слизи не остается никаких действующих веществ. Все из-за ферментов, которые останавливают работу выполнивших свою функцию пептидов до того, как они смогут навредить организму хозяйки. Но и для этой проблемы нашлось решение. Одним из наиболее эффективных вариантов является смыв слизи с кожи водой в контейнер с метанолом, который дезактивирует ферменты. Полученный водно-метанольный раствор фильтруют, а фильтрат используют для изучения активных пептидов. Эти методы будут использоваться и в будущих исследованиях. Уже планируется выяснить действие новых пептидов на грибки, бактерии и вирусы, а также изучить их противораковый потенциал. Ученые собрали особей других видов и теперь выясняют возможность альтернативных способов стимулирования секреции слизи.
«Главная проблема современных лекарственных препаратов заключается в том, что вредные микроорганизмы быстро вырабатывают к ним устойчивость. Фармакологические компании тратят миллионы на разработку новых антибиотиков, а в результате большая их часть через некоторое время становится бесполезной. С активными пептидами из кожного секрета травяной лягушки все по-другому. Так как они совершенно иначе действуют на микроорганизмы, бактерии не вырабатывают к ним устойчивости, хотя природа их воздействия до конца еще не изучена. Именно по этой причине лягушки живут на планете уже более 300-400 миллионов лет. Вот почему мы надеемся, их пептиды могут стать основой для лекарств будущего поколения», — пояснил Альберт Лебедев.